Den nye Lombardi og Mikovits-studien – Notater på norsk

To sekunder etter at jeg postet forrige innlegg fikk jeg forespørsel om en oversettelse av den nye studien som i dag ble publisert online med åpen tilgang. Jeg har printet ut og lest gjennom artikkelen nå, og nedenfor finner dere noen notater på norsk.

Merk: Jeg er ikke helsepersonell. Jeg er ikke forsker i retrovirologi. Dette er kun min oversettelse av en del utdrag fra den publiserte studien, og må ikke leses som noe annet.

Jeg forventer at ME-bloggene over hele verden vil gå varm de nærmeste dagene som følge av denne publiseringen, og jeg skal forsøke å videreformidler analyser og oppsummeringer av studien etter hvert.

Men her er altså det dere får nøye dere med foreløpig! 🙂

~ ~~~~~~~~

Førstesiden av studien – fulltekst her

Xenotropisk Murine Leukemi Virus-relatert Virus-assosiert kronisk utmattelsessyndrom avslører en distinkt inflammatorisk signatur

(Inflammatorisk: inflammasjon betyr betennelse.)

Av: Vincent C. Lombari, Kathryn S. Hagen, Kenneth W. Hunter, John W. Diamond, Julie Smith-Gagen,. Wei Yang og Judy A. Mikovits

Involverte institusjoner: Whittemore Peterson Institute, Triad Medical Center, Nevada Center for Health Statistics and Informatics, University of Nevada og Department of Microbiolkogy and Immunology Applied Research Facility, University of Nevada Reno. (Alle institusjonene ligger i Reno, Nevada, USA).

—-

Sammendrag:

(Her er hele sammendraget, eller «abstract» oversatt).

Bakgrunn: Den nylige identifikasjonen av xenotropisk murine leukemi virus-relatert virus (XMRV) i blodet til pasienter med kronisk utmattelsessyndrom (CFS) etablerer at et retrovirus kan s pille en rolle i denne sykdommens patologi. Kunnskap om immunresponsene kan føre til en bedre forståelse av den rollen XMRV spiller i dette syndromet. Vårt mål var å undersøke cytokin- og chemokin-responsene (Merk: Les om cytokiner her) i XMRV-assosiert CFS.

Materialer og metoder: Ved å bruke Luminex multi-analyte profileringsteknologi, målte vi cytokine- og chemokin-nivåene i plasma fra XMRV-infiserte CFS-pasienter og sammenlignet disse dataene med friske kontroller. Analysen ble utført ved å bruke Gene Expression Pattern Analysis Suite og Random Fores tre-klassifiserings-algoritmen.

Resultater: Denne studien identifiserer en signatur av 10 cytokiner og chemokiner som korrekt identifiserer XMRV/CFS-pasienter med 93% spesifisitet og 96% sensitivitet.

Konklusjon: Disse dataene viser, for første gang, et immunologisk mønster assosiert med XMRV/CFS.

Merk: Så kommer selve studien. Her har jeg ikke gått i detalj, for siden jeg ikke har fagkunnskapen om metodologien som er brukt, så blir det veldig vanskelig å oversette metodedelen riktig. Det som følger nedenfor er det derfor noen hele tekstbiter og noen utdrag. Hele studien kan hentes her. Jeg har forsøkt å sette mine kommentarer i kursiv, og forteller underveis hvilke deler av artikkelen vi er i, og hva det sier oss. Hopp til slutten hvis du kun er interessert i konklusjonen. 😉

1. Introduksjon

Først begynner de artikkelen med å skrive litt om CFS og immunsystemet. Jeg tar med dette her, for de beskriver ME/CFS på en mer biomedisinsk måte en vi kanskje er vant til.

«Kronisk utmattelsessyndrom (CFS) er en dårlig forstått sykdom av ukjent etiologi, som vanligvis er karakterisert av uspesifikke immundefekter, kronisk immunaktivasjon og dysregulering, noe som ofte fører til nevrologiskeplager. Det kan også involvere andre biologike systemer slik som muskel/skjelett, gastrointestiale og endokrinologiske systemer. Selv om flere vanlige symptomer vanligvis rapporteres og er dominerende kan de variere fra person til person, og er ofte svingende og kan pågå i åresvis, noe som ofte resulterer i betydelig funksjonshemming. Noen av de mest vanlige rapporterte fysiske symptomene inkluderer muskelsvakhet og smerte, ømme eller hovne lymfeknuter og kroniske influensaliknende symptomer. Hukommelse- og konsentrasjonsforstyrrelser, tåkesyn, svimmelhet og søvnforstyrrelser representerer noen av de kognitive symptomene man typisk observerer mens immunologiske symptomer ofte manifesteres gjennom viral reaktivering, RNase L-dysregulering, redusert natural killer (NK) celle-funksjon og følsomhet for opportunistiske infeksjoner. NK-celle dysregulering kan være assosiert med viral reaktivering eller pågående virusinfeksjoner og kan også føre til malignitet. Faktisk underbygger kliniske observasjoner patologiske manifestasjoner i CFS som virale reaktiveringer, spesielt herpesvirus slik som cytomegalovirus (CMV), Epstein-Barr virus (EBV) og human herpes virus-6 (HHV-6) er vanlige forekomster. Videre har epidemologiske studier rapportert økte forekomster av lymfom (kreftsykdom fra celler i lymfesystemet, min anm.) assosiert med CFS-utbrudd. Disse kliniske observasjonene tyder på at et kompromittert medfødt immunsystem kan spille en rolle i patologien bak CFS.»

Merk den siste linjen hvor de sier at dette kan handle om medfødte svekkelser i immunsystemet.

Så kommer det noe om det Human Genome Project hvor man kunne identifisere RNASEL-genet som stod bak arvelighet i prostatakreft. «Denne oppdagelsen fikk Robert Silverman og hans kolleger til å søke etter en virus-komponent i arvelig prostatakreft.» De fant altså at personer med arvelig prostatakreft hadde et retrovirus som ikke hadde blitt oppdaget før – XMRV.

Så forteller de om hvordan de i laboratoriet på WPI klarte å identifisere og finne infektiøs/smittsomt XMRV i blodet til 67% av CFS-pasienter. De fant ut at pasientene var infisert med en type XMRV som var mer enn 99% identisk til tidligere sekvenser av viruset man hadde funnet, men som var klart forskjellig fra den eneste eksisterende XMRV-molekylære klonen, VP62. Dette, sier artikkelen videre, utelukker enhver mulighet for kontaminering og representerer i tillegg den første identifikasjonen og isoleringen av naturlig forekommende infektiøs XMRV.

«Sammenhengen mellom CFS og XMRV ble videre støttet av studier fra Lo et.al., som identifiserte murine leukemia virus (MLV)-related sequences i blodet til 86% ac CFS-pasienter, noe som videre etablerte en retroviral assosiasjon med CFS.»

Videre forteller de om retrovirus og cytokiner:

«Per i dag kjenner vi til tre familier av retrovirus som infiserer mennesker: humant immunsviktvirus (HIV), human T-cell lymphotropic virus (HTLV) og nå de human murine leukemi-relaterte virusene. Både HIV og HTLV er kjent for dysregulering av det uspesifikke immunsystemet og for fremme produksjone av inflammatoriske cytokiner og chemokiner. I lys av assosiasjonen mellom XRMV og CFS, er det ikke overraskende at noen av de mest fremtredende observasjonene i CFS er forskjellene i cytokiner og chemokiner sammenlignet med friske kontroller. Tidligere rapporter har i sin undersøkelse av disse molekylene i CFS gitt motstridende resultater. Mye av dette kommer av slike hindringer som et lavt antall prøver, et begrenset antall cytokiner undersøkt på samme tidspunkt, utilstrekkelig pasient-populasjon stratifisert utvelgelse, og utilstrekkelige negative kontroll-subjekter. Dette har resultert i inkonsistente rapporter i litteraturen for et antall cytokiner inkludert interleukiner (IL) 6, 10 og 12. På tross av disse motstridende resultatene, har et visst antall cytokiner og chemokiner vist seg å konsekvent være assosiert med ulike undergrupper av CFS. For eksempel har Natelson et. al. vist forhøyede nivåer av IL-8 og IL-10 i spinalvæsken hos pasienter med plutselig influensa-lignende start på CFS-sykdommen, sammenlignet med friske kontroller. I tillegg har Chao et. al. vist at neopterin og IL-6 har vært oppregulert i undergrupper av CFS-pasienter, noe som indikerer en pro-inflammatorisk immuntilstand. Disse studiene har likevel ikke analysert det kompliserte forholdet mellom flere cytokiner og klinisk sykdom.

Ved å ta i bruk konvensjonell statistisk analyse og «maskin logiske» algoritmer på de multiplekse data, er det mulig å identifisere cytokiner og chemokiner som er forskjellig uttrykt i de to gruppene. For å støtte dette premisset, har vi brukt xMap (R) multi-analyte profileringsteknologi som tillater simultane målinger av multiple biomarkører i serum eller plasma. I denne studien ble et panel av 26 cytominer, chemokiner og vekst og angiogeniske faktorene ble analysert i blod-plasma fra CFS-pasienter og friske kontrollpersoner. Denne studien avdekker en signatur av 10 cytokiner og chemokiner, som viser en spesifisitet på 93% og en sensitivitet på 96% i diagnostisering av XMRV-assosiert CFS i denne pasientkohorten.»

Ok, det var innledningen. Den siste setningen er selvfølgelig den viktigste, for den forteller oss at dette muligens kan være en diagnostisk test! (Slik jeg forstår det. Men vi skal lese videre.)

2. Materiale og metoder

I denne delen forteller de først om pasientutvalget:

«Ett hundre og atten (118) prøver fra pasienter som hadde testet positivt for XMRV og med en bekreftet CFS-diagnose på prøveinnsamlings-tidspunktet ble samlet inn fra Whittemore Peterson Institute sitt depot. Alle prøver brukt i denne studien var heparinisert plasma og representerte en kvinne til menn ratio på omtrent 2 til 1, konsistent med tidligere rapportert utbredelse av CFS. Pasientene gjorde sin legeavtale omtrent to måneder før blodprøven ble tatt, og de observerte resultatene er derfor usannsynlig å korrelere med noen korttids-sykdom eller fluktuering som årsak til legebesøket. Alle pasientene beskrevet i denne studien representerer veldefinerte kohorter av CFS-pasienter som er kjent for å ha en «virus- eller influensaliknende» begynnelse, og har testet positivt for XMRV ved PCR og/eller serologi. Ett hundre og trettiåtte (138) kontroll plasma-prøver ble gjort tilgjengelig av en lokal medisinsk praksis, underlagt Universitetet i Nevada, Reno IRB godkjent, også med en kvinne til menn ratio på omtrent 2 til 1. Kontrollpersonene donerte blod som ledd i en rutinekontroll og ble ansett for å være friske på det tidspunktet.»

Det var litt om pasientutvalget, og her kunne det kanskje stått noe mer om hvilke diagnosekriterier de pasientene var diagnostisert med? Jeg nevner det fordi det er jo ofte dette vi etterspør i andre studier, så det virker bare rett og rimelig å etterspørre det her også.

Videre forteller de mer teknisk om hvordan de tok blodprøvene og hvordan plasmaet ble lagret. Det går jeg ikke i detalj på her.

Så kommer det en del om denne multiplex-analysen hvor de tester mange biomarkører samtidig. Dette går jeg ikke i detalj på her, interesserte må lese artikkelen selv. Det kan bemerkes at denne teknologien gjør det mulig å analysere 100 individuelle cytokiner samtidig. De brukte et panel som testet 25 cytokiner samtidig i denne undersøkelsen.

3. Resultater

Dette er også en ganske teknisk del, hvor de beskriver mye av funnene på cytokiner.

«Analyse av plasmakonsentrasjoner av cytokiner og chemokiner i XMRV-infiserte CFS-pasienter. For å utvikle en cytokin/chemokin-signatur, var det først nødvendig å bestemme graden av differensielt uttrykk mellom en stor pasientpopulasjon og en verifisert frisk, alders- og kjønns-matchet kontroll-populasjon. For å undersøke enhver potensiell forskjell mellom disse to populasjonene ble konsentrasjonene av 26 forskjellige plasma-markører, tilhørende de forskjellige immunologisk funksjonelle klassene, evaluert av Luminex (R) eller ELISA, som beskrevet ovenfor. Analysene ble utført ved å bruke plasmaprøver fra friske kontrollpersoner og fra pasienter med en bekreftet diagnose med CFS, representert ved en omtrentlig kvinne til menn ratio på 2:1 respektivt. (Se Tabell I). Multippel regresjonsanalyse ble brukt for å undersøkte påvirkningen av alder og kjønn i tillegg til case eller kontrollgruppe. Disse variablene kunne generelt bare forklare 20% av variasjonen i seks av cytokinnivåene (IL-6, IL-12, TNF-α, IP-10, eotaxin og MCP-1). Denne forskjellen påvirket ikke den samlede effekten av de respektive cytokinene. Av de 26 cytokinene og chemokinene som ble analysert, var det 19 som var differentielt uttryks som bestemt av log-transformert Students t-test på 99% konfidensnivå: 11 var oppregulert, 8 var nedregulert og 7 rakk ikke statistisk signifikans når man sammenligned CFS-gruppen med kontrollgruppen (Tabell II). Majoriteten av de oppregulerte faktorene var medlemmer av CXC eller CC chemokin-familien. Den største statistiske forskjellen ble sett i chemotactic faktor IL-8, en hoved-mekler i den inflammatoriske responsen, med en gjennomsnittsverdi på 1045±245 pg/mL hos pasienter sammenlignet med et gjennomsnitt på bare 13.1±1.6pg/mL sett hos friske kontroller. De andre oppregulerte chemokinene, også fra CXC eller CC familien, var MIP-1β, MIP-1α, IP-10, eotaxin, MCP-1 og TANTES, to medlemmer av cytokin-familien IL-2 og TNF-α var også oppregulert.»

Av de cytokinene og chemokinene som var statistisk nedregulert, var den mest signifikante T-celle inflammatorisk hemmeren IL-13. Selv om de var statistisk signifikant, men nedregulert i mindre grad var IL-5, IL-7, MIG, IFN-α, IL-IRA, GM-CSF og IL-4. De faktorene som ikke nådde et statistisk signifikant nivå var IL-1β, IL-2R, IL-10, IL-15, IFN-γ og IFN-β (Tabell II).»

OK, dette var veldig teknisk, men jeg tok det med likevel for at vi skulle se navnene på hvilke cytokiner som «utmerket» seg – det vil si var så forskjellige hos CFS-pasientene at det ikke kunne være tilfeldigheter (statistisk signifikant).

Deretter kommer et avsnitt som heter «Comparison of γ-δ T-cell clonal and non-clonal XMRV-infected CFS patients and healthy controls». Dette overlater jeg til de som vil lese selv. 🙂 Det handler om ytterligere testing for å sjekke at resultatene ikke skyldes tilfeldigheter. Jeg finner en interessant setning her som jeg skal se litt mer på:

«Disse dataene støtter tydelig konseptet om unike XMRV/CFS-subgrupper basert på γ-δ T-celle klonalitet.»

Kan dette bety at de har vist en måte å differensiere subgrupper av pasienter på?? Det viser seg også i den videre analysen at fem av de viktigste cytokinene og chemokinene var forskjellig mellom pasientgrupper!

Så kommer det noe om «Random forest signature.» Det skal jeg prøve å oversette litt mer, selv om det er teknisk – fordi det handler om en diagnostisk test.

«For å utvikle en cytokin og chemokin-signatur som til slutt kan føre til et diagnostisk verktøy, benyttet vi Random Forest data-gravings programvare-pakken ved å bruke pasientstatus som målvariabel og cytokin og chemokin-verdier som prediktive variabler.»

De ser altså på denne forskningen som et skritt på veien til en diagnostisk test! Videre er det noen setninger om hvordan analysen ble gjennomført, det tar jeg ikke med her. Avsnittet avsluttes med følgende setning:

«Den endelige modellen kunne nøyaktig identifisere 128 av de 138 kontrollene (93% spesifisitet) og nøyaktig identifisere 113 av 118 pasienter (96% sensitivitet).»

De har altså vist at de kan lage en modell for cytokin- og chemokin-uttrykk som er forskjellig fra pasienter og kontroller, og at denne modellen nøyaktig kan identifisere hvem som er XMRV/CFS-pasienter og hvem som er friske kontroller.

4. Diskusjon

I denne delen diskuterer forskerne resultatene og betydningen av dem.

«Formålet med denne studien var å evaluere forskjeller i cytokine og chemokin-profiler mellom XMRV-infiserte CFS-pasienter og friske kontrollpersoner. Studien demonstrerer klart at XMRV-infiserte CFS-pasienter fremviser en inflammatorisk cytokin og chemokin-signatur som skiller dem fra friske kontrollsubjekter.»

Dette er en utrolig viktig setning! Videre:

«Selv om korrelasjonen mellom XMRV og CFS er betydelig, har tidligere studier utført av vårt laboratorium og de rapportert av Lo et.al. vist at en liten, men signifikant andel av kontrollpopulasjonen også er infisert med XMRV eller potensielt andre human murine leukemia relaterte virus. Den kliniske betydningen av dette er ukjent på det nåværende tidspunkt, men uansett vil tilgjengeligheten av komplette virale genom-sekvenser fra mange symptomatiske og asymptomatiske individer kunne føre til en større forståelse for hvorfor noen individer manifesterer symptomer på nevroimmun sykdom, mens andre ikke gjør det. Hvis fremtidige studier etablerer at sykdomsstatusen ikke er bestemt av XMRV-variasjon, er det mulig at andre tilstander, slik som et kompromittert immunsystem, disponerende genetikk eller co-infeksjoner med andre patgener kan være nødvendig for å manifestere sykdommen. Selv om disse relasjonene er kompliserte, vil mutiplex suspensjon analyse («multiplex suspension array») gi muligheten for å analysere de komplekse relasjonene mellom cytokiner og klinisk sykdom og til å bestemme om kliniske undergrupper også eksisterer. Faktisk, har slik analyse vist seg effektiv i å opptegne andre sykdommer med subtile forskjeller, slik som å skille ikke-inflammatorisk fra idiopatisk ocular regnbuehinnebetennelse. Selv om funnet av XMRV-infeksjon på det nåværende tidspunkt ikke er en definitiv stand-alone diagnostisk verktøy for nevroimmune sykdommer eller maligniteter, kan en kombinasjon av XMRV og cytokin/chemokin-analyse vise seg å være en pålitelig diagnostisk strategi og kan assistere i å overvåke behandlingens suksess. Slik analyse kan også gi innsikt i patologien som er ansvarlig for progresjonen fra asymptomatiske til symptomatiske XMRV-infeksjoner. For eksempel er det virale reservoaret til XMRV ikke kjent, men imidlertid hvis den cellulære infiltrering i produksjonen av IL-8 er identifisert, kan reservoaret avsløres.«

Nå hopper jeg over et veldig teknisk avsnitt om spesifikke cytokinresponser – det handler om aktivering av immunresponser og at det stemmer med det man ser hos CFS-pasientene med vedvarende virus-reaktivering og kontroll over virusinfeksjoner. Videre snakker de om disse γ-δ T-cellene, som spiller en aktiv rolle i reguleringen og løsningen på patogen-induserte immunresponser – det betyr altså når man har fått et smittestoff i seg og immunsystemet reagerer. Slike γ-δ T-celler samler seg på steder hvor man finner inflammasjoner assosiert med virale, bakteriale og parasitiske infeksjoner og autoimmune sykdommer. De sier også at:

«Denne studien støtter hypotesen om at CFS-pasienter har en større risiko for å utvikle lymfomer som en konsekvens av deres inflammatoriske tilstand.»

Artikkelen avsluttes med følgende avsnitt:

«Resultatene av denne studen foreslår at multiplex cytokine og chemokin-analyse sammen med XMRV-testing kan være en nyttig diagnostikk for CFS. I tillegg støtter disse resultatene videre beskrivelsen av XMRV-relatert CFS som en inflammatorisk sykdom og kan forklare, delvis, en økt risiko for lymfomer assosiert med XMRV-infiserte CFS-pasienter.»